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低速冷凍離心機提取細胞質和細胞核蛋白的操作步驟

2017/11/26 22:36:06??????點擊:

提取細胞質和細胞核蛋白離心詳細步驟:

1.決定細胞生長狀態(tài),細胞生長狀態(tài)應該是80%或者更好:

2.用離心機以1500r/min離心5min

3.棄上清液,用等體積的冷PBS洗細胞,像步驟2那樣,反復3次

4.根據估計的沉淀量加入5倍體積的isotonic lysis buffer到細胞顆粒中,使細胞溫和懸浮,盡量避免泡沫

5.加入裂解液lysis buffer在懸浮的細胞中,并放在冰上15min讓細胞膨脹,可以通過顯微鏡檢查

6.對于細胞實驗中膨脹的細胞,加入10%的IGEPAL CA-630使最后的濃度達到0.3%,混勻,加的時候要溫和

7.立即離心(量大的可以用1.5ml的 EP管,以5500r/min離心30s;量大的可以用50ml的管子以5500r/min離心2min)

8.轉移上清液(細胞質蛋白)到一個新的冷凍管中

9.用懸浮顆粒5倍體積的isotonic lysis buffer懸浮細胞,并混勻

10.用離心機離心細胞懸浮液,以1500r/min離心5min,移掉上清液

11.用2/3倍體積的extraction buffer懸浮顆粒

12.把管子放置在震蕩混勻器上,以700r/min,15min震蕩混勻,接著以1400r/min,15min,整個過程要仔細,避免泡沫產生

13.以9400r/min離心15min,低溫離心完后轉移上清液到一個新的冷凍離心管中

14.分成幾份用液氮冷凍,并且保存起來(長期保存應放在-80℃上,短期保存要放在-20℃上)

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